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不同产地丹参脂溶性成分的比较研究

[   发布日期:2017-8-28   来源:成都普菲德生物技术有限公司   浏览次数:402   ]

不同产地丹参脂溶性成分的比较研究

晓燕

*

成都中医药大学药学院

中药材标准化教育部重点实验室

四川成都

611137

不同产地丹参脂溶性成分的比较研究

晓燕

*

成都中医药大学药学院

中药材标准化教育部重点实验室

四川成都

611137

摘要[目的]:建立不同产地丹参5种脂溶性成分二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参酮的含量测定方法,比较不同产地丹参脂溶性成分含量的差异。[方法]以不同产地丹参为材料,用HPLC法测定,色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱(Analytial4.6×250mm,5μm),以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长为270nm,柱温为25℃,进样量为20μl。
[结果]:二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参酮、丹参酮ⅡA的线性范围分别为0.0099~0.9900、0.0207~3.1050、0.0196~1.9600、0.0217~2.1700、0.0414~4.1400μg/ml(R2分别为0.9998、0.9999、0.9996、0.9998和0.9998),线性关系良好;平均回收率分别为99.92%、100.15%、100.10%、99.96%和100.34%;RSD分别为0.957%、1.175%、1.038%、1.156%和1.04%。不同产地丹参中5种成分含量差别较大。[结论]该方法稳定可靠,重现性好,可用于丹参中脂溶性成分的测定。

丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)为唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属(Salvia)植物,分布广泛,主产于四川、河南和山东等。丹参的干燥根及根茎,具有活血化瘀、凉血消肿和清心除烦的功效[1],主要活性成分可分为脂溶性丹参酮类和水溶性丹酚酸类[2]。现代药理学研究表明,丹参中酚酸类和丹参酮类成分均具有明显生物活性[3-5]。其中,脂溶性丹参酮类化合物主要具有抑菌消炎[6]、抗肿瘤[7-8]、保护心血管系统[9]、清
除自由基[10]等药理活性。由于受产地、气候和生态环境等地的影响,不同产地丹参所含成分差异较大[15-17]。且丹参的产地较多,在现有的报道中不同学者对各地丹参化学成分分析的结果和结论相去甚远[11-14]
。笔者采用高效液相色谱(HPLC)法,建立色谱条件和样品前处理方法,测定丹参5种脂溶性成分(二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和1,2-二氢丹参酮),并对16个产地丹参活性成分进行含量测定,旨在全面控制丹参的质量。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。
采集丹参各产地栽培或野生丹参的根及根茎,样品采集后快速运回实验室。样品经成都中医药大学陈新教授鉴定为丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)的根及根茎。
1.1.2主要仪器。
Agilent1200高效液相色谱仪:包括在线脱气机(G1322A)、四元素泵(G1311A)、DAD二极管阵列检测器(G315C1260)和Agilent色谱工作站,购自美国Agilent公司;电子分析天平(SartoriusBP211D和SartoriusBP121S),购自赛多利斯公司;KQ5200E型超声仪,购自昆山舒美超声仪器有限公司。1.1.3
主要试剂。丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和1,2-二氢丹参酮对照品,全部为实验室自制,高效检测纯度为98%。二氢丹参酮Ⅰ(批号130223),购自成都普菲德生物技术有限公司

1.2方法
1.2.1色谱条件。
色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为:A相为乙腈,B相为水,梯度洗脱,A相:0~21min,55%~62%;21~30min,62%~100%;B相:0~21min,45%~38%;21~30min,38%~0;流速为10ml/min;进样量为20μl;柱温为室温;检测波长为270nm。

1.2.2对照品溶液的配制。
分别精密称取对照品置棕色容量瓶中,以无水甲醇为溶剂,配制成单组分对照品溶液,再配制混合对照品溶液,
其中含二氢丹参酮Ⅰ49.50μg/ml、丹参酮Ⅰ98.00μg/ml、1,2-二氢丹参酮108.50μg/ml、隐丹参酮103.50μg/ml、丹参酮ⅡA207.00μg/ml。

1.2.3供试品溶液的制备。
快速精密称定1.000g已粉碎鲜丹参粉,转移到三角瓶中,置具塞锥形瓶中,精密加入10ml无水甲醇,密塞,称定重量,过夜,超声提取1h,冷却后再称定重量,加无水甲醇补足减失重量,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,备用。

1.2.4方法学考察。
(1)系统适应性试验。取供试品溶液和对照品溶液,按上述色谱条件进样,并进行测定,作出光谱图,考察系统适应性。
(2)线性关系的考察。取上述混合对照品溶液,分别进样1.0、2.5、5.0、10.0、15.0和20.0μl,按确定色谱条件进样,测定峰面积,各对照品分别以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,绘制标准曲线,计算线性回归方程。
(3)系统精密度试验。精密吸取混合对照品溶液20μl注入液相色谱仪,
连续进样5次,计算所测二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参酮、丹参酮ⅡA5个组分的峰面积的相对标准偏差(RSD)。
(4)重复性试验。取山东临沂丹参样品,
精密称取5份,每份1.000g,按供试品制备方法处理,进样20μl,测定样品中二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参酮和丹参酮ⅡA的含量。
(5)稳定性试验。取山东临沂丹参供试品溶液分别在0、2、4、8、12和24h进样20μl,测定样品中二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参酮和丹参酮ⅡA的含量。
(6)加样回收率试验。精密称取已知含量的丹参样品(山东临沂)适量共9份,3份为一组,分别加入3种不同浓度混合对照品溶液,按供试品溶液制备方法处理,进样后测定含量,计算平均回收率和RSD。

1.2.5样品含量测定。
取不同产地的丹参样品,按供试品溶液的制备方法处理,进行HPLC分析,计算不同产地丹参中脂溶性成分的含量。

2结果与分析
2.1方法学考察
(1)系统适应性试验。
图1~2表明,对照品溶液和供试品溶液在相同的保留时间上有对应的吸收峰,
且各峰之间无明显影响,表明该方法系统适应性良好。(2)线性关系的考察。由表2可知,在各自的范围内,各对照品浓度与峰面积的线性关系良好。(3)系统精密度试验。计算所测二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参酮、丹参酮ⅡA5个组分的峰面积的相对标准偏差(RSD)均小于2.0%,表明精密度良好。(4)重复性试验。计算得5种所测成分的RSD均小于1.0%,表明提取和检测方法的重现性好。(5)稳定性试验。计算得5种所测成分的RSD均小于2.0%,供试品溶液在24h内稳定,表明稳定性良好。(6)加样回收率试验。计算得二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、1,2-二氢丹参酮和丹参酮ⅡA的平均回收率分别为99.92%、100.15%、100.10%、99.96%、100.34%;RSD分别为0.957%、1.175%、1.038%、1.156%和1.04%(表3),表明该方法准确,可靠,可用于丹参中脂溶性成分的测定。

2.2样品含量测定结果由表4可知,5种成分中,二氢丹参酮Ⅰ在各样品中量差异较大,最大可达22倍。丹参酮ⅡA来自同一个省的不同产地的丹参样品含量差异也较大,其中来自山东省临沂和临朐的样品丹参酮ⅡA的含量分别为0.4764和2.3960mg/g,相差近5倍;来自陕西蓝田和商洛的样品丹参酮ⅡA含量分别为0.3723和1.7616mg/g,相差近5倍。

3.结论与讨论
相关文献报道[18-19],丹参酮丹参酮ⅡA等脂溶性成分用甲醇回流提取效果最佳。杨新杰等以100%甲醇为提取溶剂,比较了过夜超声提取1h、回流提取1h和索氏提取5h的提取效果。结果表明,超声提取、回流提取和索氏提取无明显差异[20]。由于丹参酮丹参酮ⅡA对热的不稳定性[21],为了尽量避免加热回流导致的成分破坏,故选用超声提取法,与郭孝武等[22]的研究相符。试验采用乙腈-水作为溶剂系统进行梯度洗脱,在该色谱条件下,丹参中5种脂溶性成分均能得到完全分离,表明该方法稳定,重现性好。

试验收集了四川、河南、山东、陕西、山西等地的家种和野生丹参,对其中的脂溶性成分进行测定。试验结果表明,不同产地丹参脂溶性成分含量差异较大。其中,山东临朐丹参的隐丹参酮、1,2-二氢丹参酮和丹参酮ⅡA含量均为最高,丹参酮Ⅰ和二氢丹参酮Ⅰ的含量以陕西商洛丹参为最高。5种成分中,二氢丹参酮Ⅰ在各样品中量差异较大,最大可达22倍。丹参酮ⅡA来自同一个省的不同产地的丹参样品含量差异也较大,其中来自山东省临沂和临朐的样品丹参酮ⅡA的含量分别为0.4764和2.3960mg/g,相差近5倍;来自陕西蓝田和商洛的样品丹参酮ⅡA含量分别为0.3723和1.7616mg/g,相差近5倍,表明不同产地的丹参质量存在明显差别,故在临床用药时应从丹参的来源进行控制。
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